出願番号：2014-028602 ／ 特開番号：2015-149960 ／ 登録番号：6353239

【課題】細胞を損傷することなく、単一細胞の生死を複数同時に生死判定する非球体細胞の生死活性判定方法及び装置。

【解決手段】底面と上面とが対向する透明電極２１ａ、ｂで構成されたセル２であって、少なくとも底面の液体接触面が、透明な絶縁性薄膜２０で被覆されているセル中に非球体細胞懸濁液２２を封入する工程と、周波数を印加しない状態の光透過率Ｔ０を測定する工程と、前記一対の透明電極に、全細胞２３、２４を直立させる周波数を印加し、光透過率Ｔ１を測定する工程と、前記一対の透明電極に、死細胞２３を選択的に転倒させる周波数を印加し、光透過率Ｔ２を測定する工程と、前記光透過率の値から、生細胞の直立割合を算出する工程とを順に含む、非球体細胞の生死活性判定方法、並びにこれを実施するための生死活性判定装置１。

出願番号：2011-281386 ／ 特開番号：2012-143231 ／ 登録番号：5939562

【課題】細胞を損傷することなく、単一細胞の生死を複数同時に生死判定する方法及び装置。

【解決手段】底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセル中の非球体細胞懸濁液に、初期周波数を印加する工程と、周波数を、判定周波数まで上昇させる工程と、前記判定周波数における非球体細胞の生死を判定する工程とを含む非球体細胞の生死活性判定方法、及びこれに用いる非球体細胞の生死活性判定装置１であって、セル２と、交流発振器３と、観察装置４と、画像表示装置５と、画像処理装置６とを備える装置を提供する。

出願番号：2019-034487 ／ 特開番号：2019-150016 ／ 登録番号：

【課題】死細胞または生細胞を選択的に、高精度で分離する、細胞の分離回収装置及び方法を提供する。

【解決手段】底面と上面とが対向する電極で構成され、少なくとも一方の前記電極と離間して、前記電極間
に設けられた微細孔絶縁膜を備えるセルと、前記電極に所定範囲の周波数を印加する交流発振器とを備え、前記絶縁性薄膜の微細孔径が、所望の細胞の最小径より大きく、最小径の２．５倍以下である、細胞の分離回収装置。

(1)Gene transfer and protein release of fission yeast by application of a high voltage electric pulse.

Anal Bioanal Chem 394 13 - 16 2009年05月

(1)交流電界印加による微細電極上の細胞配向を用いた高精度細胞活性測定システムの開発

運本課題は細胞への電気効果を利用した細胞活性測定システムで,従来のセンサでは達成できない非侵襲で個々の細胞の生死状態を迅速に測定するシステムを開発した.昨年度は交流電界印加により細胞を配向させる透明電極の試作によって測定原理及び電極構造や測定条件などを検討し,顕微鏡下で細胞の向きを判別することで細胞の生死判定を可能にした.今年度は従来法である蛍光染色法との比較,分光器による透過率測定による電界配向の検出,また他の微生物細胞での可能性の検証を行った.
食品製造や医薬品製造の発酵プロセスにおける効率的な生産には,微生物細胞の生死状態を把握することが非常に重要である.現在,測定方法として染色法やコロニー計数法があるが,細胞毒性や生育時間などの問題がある.本測定法の特徴は電界印加による細胞の誘電的異方性に基づく方向変化を光学的に検出することで生死判定するという新たな原理である.
非球形細胞の分裂酵母菌で検討した判定条件を用いて,従来法の1つである蛍光染色法と同等の精度で生死判定することが可能であった.さらに本測定法は染色による細胞毒性はなく蛍光顕微鏡のような高価な装置も必要ない非常に簡素なシステムという特徴がある.さらに今回顕微鏡を使用せず分光器の透過率測定によって電界配向を検出でき,より簡単に測定することが可能となった.また他の非球形なバクテリアでも電界配向による生存判定が可能であることが確認できた.

(2)細胞チップを用いた超高効率遺伝子導入が可能な高速スクリーニングシステムの開発

本研究は,酵母細胞を固定化した細胞チップを用いて,超高効率に遺伝子を導入し,短時間で導入した細胞をスクリーニングするシステムを新規に開発することが目的である.まず装置の設計製作において,既に代表者が遺伝子導入に使用している自製のコンデンサの充放電による直流高電圧パルス発生装置を改良し,極小電極間で適用可能な範囲のパルス条件(1〜5V,1〜10msec)を試行できる導入装置を設計製作した.また,遺伝子導入用細胞チップ用の電極は,細胞の固定化や観察も考慮して電極形状や材質などを検討し,具体的に顕微鏡下での観察も可能にするためスライドガラスに液晶などに用いられている酸化インジウムスズを蒸着した透明電極を作成した.特に遺伝子導入条件を検討するため,製作したパルス印加装置と上記の透明電極や従来のアルミニュウム製電極を用い,従来は電極間2mmで実施していたものを,酵母細胞直径レベルに近づけるため電極間100μmで電圧パルスの印加を行った.ここでは数種類の酵母菌の栄養要求性変異株とそれを相補する遺伝子を組み込んだプラスミドDNAを用いて,電圧パルス印加後の細胞懸濁液を寒天最少培地上に直接プレーティングしスクリーニングを行い,微小電極間での遺伝子導入に最適な放電パルス条件と生理的条件の知見を得た.同様に乳酸菌においても同様の実験を行った.また,このときの細胞を懸濁する溶液は非電解質の糖類を使用することで火花を防ぐと共に浸透圧など遺伝子導入効率に重要なファクターとなった.

(3)電気効果を利用した菌体内有用物質の選択的放出分離回収システムの開発

本研究は,電気効果を生物プロセスの技術に応用発展させ,効率的に菌体からバイオ有用物質を生産するシステムを開発することを目的とする.
既に平成14年度には,直流高電圧パルスによる細胞膜破壊を利用した電気放出によって,菌体内有用蛋白質を選択的に放出させる技術を確立するため,高電圧放電パルスを印加する装置を製作し,菌体内に特異的に存在する蛋白質を放出させることに成功した.
さらに平成15年度には,従来の煩雑な分離精製工程を減らすため,電気泳動によって菌体内から蛋白質を直接分離する技術を確立するため,菌体と蛋白質を電気泳動により直接分離させることに成功し,また分離した蛋白質を電気泳動によって限外ろ過膜上に回収することも可能となった.
本年度は,平成14年度,15年度に製作した装置で得られた結果をもとに,諸々の問題点を再検討した.これまでの問題点を解消し,最終的に透過性の向上した細胞内から連続した蛋白質の回収を可能にするシステムを構築することが可能となった.

(4)電気効果を利用した酵母菌への遺伝子導入と蛋白質放出及びその凍結保存法の開発

本研究は,電気的効果として交流電界や直流高電界を用いて,具体的に生命研究に必須の遺伝子導入技術,細胞の凍結保存技術,有用蛋白質の放出技術に応用発展させることを目的とする.
1.高電圧直流パルスによる酵母細胞内からの蛋白質放出
従来は遺伝子導入にのみ用いられていた高電圧パルスによる細胞膜の可逆的破壊を利用して,細胞の生存活性を維持したまま細胞内部の蛋白質を有効に放出させることを試みた.遺伝子導入用の高電圧パルス発生装置を用い,酵母細胞に高電圧パルスを印加したときの外溶液中に含まれる蛋白質を新規に購入した電気泳動装置などで分析した.細胞の培養条件や菌種,さらには高電圧パルスの電界強度や時定数,印加回数などを検討し,細胞内の蛋白質を放出させることが可能となった.これにより将来的には医薬品のような生理活性蛋白質など大有効な生産が期待できる.
2.ストレス応答による高電圧パルス耐性を利用した遺伝子導入効率の向上
細胞にストレスを与えると,それに応答してストレス蛋白質をコードする遺伝子が速やかに活性化される.また,予めストレスを与えた細胞は,凍結処理や高圧環境などの2次ストレスに対する耐性を獲得する.ここでは高浸透圧のストレス応答による2次ストレスとしての高電圧パルス耐性の影響を新たに確認した.結果として,直流高電圧パルスを用いた遺伝子導入法で,高浸透圧ストレス処理によって従来法に対して大幅に遺伝子導入効率を向上させることが可能となった.これにより生命研究分野のさらなる発展が期待できる.